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从微升走向纳升,“后PCR时代”下需要关注的几个问题

时间:2020.06.17

1983年,Mullis在水浴锅中实现了DNA体外复制的伟大壮举,奠定了分子生物学的研究基础。随后,Taq酶的发现及仪器的发明促进了PCR技术的推广使用。如今,以微流控芯片和微滴技术为代表的第三代PCR技术正处于高速发展阶段,PCR反应开始向小体积、高通量、高灵敏度的特性过渡。


纳升体系SNP基因分型芯片及扩增平台



在以往的PCR实验中,反应的“五要素”常被认为是影响结果的关键因素,即引物、酶、dNTP、模板及Mg2+浓度。近年来,以仪器-耗材-试剂组成的反应系统越来越引起关注,三者之间质量不一或兼容性差也会导致最终的实验效果不佳。

1PCR仪器选择及功能设置

仪器的控温方式、荧光器件及数据处理都会影响反应的最终结果,在使用时要仔细了解仪器的各项设置及注意事项,避免操作不当影响最终的反应结果。

①变温速率是不是越快越好:由于升降温速率大幅度提高,使得聚合

酶延伸的时间缩短,并不能保证PCR具有最佳的扩增效率及特异性,同时也会导致芯片出现气泡及蒸发问题。为此,对于特殊的实验而言,为获得稳定的反应条件,降低变温速率是一个较好的选择。

②低温保存功能的设置:低温保存功能使用的前提是不能将PCR

仪当成冰箱进行长时间的使用,损耗机器的同时也增加了实验结果的不确定性。对于一般实验而言,低温设置为12℃左右即可满足需求。



 仪器高级设置中可对变温速率进行设置


2、酶系统的选择及使用

普通的PCR实验选用Taq酶即可。对于特殊实验,酶的主要区别在于特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度等几个指标。如Pfu聚合酶适合保真度要求较高的实验(点突变、基因筛选等);Long TaqTaq Plus聚合酶适合高保真长片段扩增(构建基因图谱等);Taq Platinum聚合酶扩增GC含量较高或二级结构较复杂的模板。对于等温PCR系统而言,LAMP使用链置换DNA聚合酶Bst聚合酶,RAA则使用包括重组酶、SSB、聚合酶及外切酶等组成的酶系统。

不同的酶具有不同的实验功能及特性,在选择时需要加以区分。除此之外,预混液的使用、试剂的储存方式及冷冻干燥方式都会对酶的活性造成影响,在使用时也要注意进行综合考虑。


  酶系统的选择及保存方式 (图片来自Seegen及博奥生物官网)


3、实验耗材导致的试剂蒸发等问题

PCR反应的耗材包括PCR管、微孔板、毛细管、芯片等。在耗材选择时一定要注意其材质、孔径、密封性、是否使用回收料等,不同耗材对试剂离心、混匀、质量损失及荧光数据采集等有着不同程度的影响。以测试96孔反应板试剂蒸发为例,使用专业的实验耗材有助于减少样本的质量损失。计算公式如下:样本质量损失(%=W3-W4/W2-W1),样本质量损失越小代表其密封性越好。其中,W1为空反应板的重量,W2为反应板加入试剂后的重量,在此基础上密封反应板后的重量为W3,在热循环结束后,记录耗材最终重量为W4


 

柏恒科技不同的反应板质量损失测试


“后PCR时代”下小体系快速实验对仪器、耗材、试剂的要求较高,所以选择专业的厂商很有必要。在实际使用中不仅要选的好,同样也要用的好。在熟悉反应系统的基础上应注意设计严谨的实验方法。同时规范每一步的实验操作,以减少实验失败的风险。